流式抗體搭配流式熒光素主要有2個原則:
*,每個通道只能選擇1種熒光素。
第二,各個通道之間的熒光素可以隨意搭配,因此需要注意:
1、流式抗體每個通道只能選擇1種熒光素。以Calibur為例說明,Calibur的FL1通道選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC ,或者選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488。Calibur的FL3通道盡管能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個熒光素,但是我們搭配的時候只能選擇其中1個。
2、各個通道之間的熒光素可以隨意搭配:如果客戶的流式細(xì)胞儀能做4個通道,在第1個原則之下,那么每個通道隨便選出1個熒光素就可以組合成4個顏色。以2跟激光的Calibur為例,Calibur各個熒光素之間可以搭配出16種組合。比如常用的搭配是F I T C( F L 1 )+P E(F L 2)+PerCP(FL3)+APC(FL4),這個搭配組合可以更改成Alex Fluro(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+APC(FL4), 或者FITC(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+Alex Fluro(FL4),或者FITC(FL1)+PE(FL2)+PE-Cy5(FL3)+APC(FL4)等等??傊?,在第1原則之下,我們可以隨意搭配和組合各個熒光素。但是需要注意的是,APC和PE-Cy5一起使用的話,上流式以后,容易導(dǎo)致補(bǔ)償過度。
流式抗體使用注意事項(xiàng):
(1)建議實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的數(shù)量和抗體的比例要適當(dāng)。細(xì)胞過量或抗體過量都可能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果受影響,因此需要優(yōu)化試驗(yàn)條件。注:不同的流式技術(shù)對抗體的需求量有較大差異,例如傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)(采用鞘液流系統(tǒng))需要1×106個細(xì)胞為起始上樣量,抗體用量為10μl,而微流式細(xì)胞術(shù)則只需5×105個細(xì)胞,抗體用量減少到5μl。
(2)直標(biāo)的流式抗體應(yīng)該4℃避光保存,不要冷凍。盡量選擇經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的流式抗體,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。