人外周血TH1/TH2/TH17染色
Tips:采集外周血的抗凝管必須是肝素抗凝管,刺激劑盡量選用凍干粉自己配置;cocktail刺激劑是液體形式,PMA會因保存不當導(dǎo)致活性降低,影響刺激效果,而凍干粉形式的PMA較穩(wěn)定,可以保證刺激效果。
人外周血TH1/TH2/TH17染色/流式檢測
細胞刺激:(刺激體系1ml)
取人外周血(肝素抗凝)200 ml加入24孔板內(nèi),加入800 ml的*培養(yǎng)基,再加入1ml PMA(25ug/ml)、1μl Ionomycin(1mg/ml),輕輕吹打混勻細胞。放入 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激0.5小時后,每孔再加入2μl Brefeldin A(5mg/ml),輕輕吹打混勻細胞,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激3.5小時。
流式檢測:
1、收集細胞于流式管內(nèi),500 g/8min離心,槍頭吸去上清,彈散管底沉淀,加入相應(yīng)的表面染色抗體(CD3\CD8),彈散混勻。室溫避光孵育15分鐘后,500 g/8min離心,槍頭吸去上清;
2、彈散管底沉淀,加入1ml的固定/破膜工作液,(1ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3ml Fixation/Permeabilization Diluent稀釋),旋渦混勻,現(xiàn)配現(xiàn)用;
3、室溫避光孵育30分鐘, 600 g/10min離心,在吸水紙上倒扣流式管棄去上清(此時細胞已在管底形成很牢固的沉淀,不容易丟 失),彈散管底沉淀;
4、加入1ml Permeabilization Buffer(此為10X,須與蒸餾水1:10稀釋成工作液)工作液離心洗滌細胞,破膜15分鐘(室溫避光), 600 g/10min,在吸水紙上倒扣流式管棄去上清,彈散管底沉淀;
5、加入100μl Permeabilization Buffer(1x),同時加入相應(yīng)的細胞因子染色抗體,室溫避光孵育15分鐘;
6、加1ml Permeabilization Buffer(1x),600 g/ 8min;在吸水紙上倒扣流式管棄去上清;彈散管底沉淀;
7、加入適量體積(建議300~500 ml)的PBS重懸細胞,并上機檢測并分析。
Tips:1、根據(jù)實驗需求選擇相應(yīng)的抗體,并做單染管用于調(diào)節(jié)補償(具體如何設(shè)置單染管,可參照后文中補償章節(jié)的介紹)。
2、盡量做同型對照,因細胞因子表達量不高(尤其是IL-4表達量非常低),細胞因子抗體對應(yīng)的同型對照一般都要做。
3、PMA刺激會導(dǎo)致人T細胞表面CD4表達的下調(diào),PMA與Lonomycin聯(lián)合刺激下調(diào)非常明顯,4h刺激后會下調(diào)50%以上,6h刺激幾乎檢測不到CD4,因此我們的界定CD4+T細胞是通過染CD3和CD8,來圈CD3+CD8-的細胞。
4、PMA對小鼠T細胞CD4表達影響很小,因此可以直接染CD4來圈門。
5、因破膜劑對細胞損傷較大,建議離心后形成的細胞沉淀先彈散形成細胞懸液,在加入破膜劑,這樣會減少對細胞的損傷(形成的細胞碎片較少)。
人外周血TH1/TH17染色結(jié)果
注意:細胞破膜后對形態(tài)影響較小,因此可以直接圈淋巴門分析,在通過圈CD3+CD8-的細胞(此處未列出圖)來分析CD4+的細胞表達細胞因子的量。因此此圖橫坐標就直接標的CD4。
人TH1/TH2/TH17染色所需抗體及輔助試劑
品牌 | 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 價格 |
BioGems | 05111-60 | Anti-Human CD3 PE | 25 test/100 tests | 700元/ |
BioGems | 10111-50 | Anti-Human CD8a FITC | 25 test/100 tests | 560元/ |
BioGems | 80811-80 | Anti-Human IFN gamma APC | 25 test/100 tests | 1680元/ |
BioGems | 81111-77 | Anti-Human IL-4 PE-Cy7 | 25 test/100 tests | 1890元 |
BioGems | 73821-60 | Anti-Human IL-17A PE | 25 test/100 tests | 1890元 |
BioGems | 44212-80-100 | Mouse IgG1 Isotype Control APC | 100 mg | 1750元 |
BioGems | 44212-77-100 | Mouse IgG1 Isotype Control PE-Cy7 | 100 mg | 1890元 |
BioGems | 44212-60-100 | Mouse IgG1 Isotype Control PE | 100 mg | 1890元 |
BioGems | 2031560-5mg | Brefeldin A 布雷菲爾德菌素A | 5 mg | 880元 |
BioGems | 5608212-1mg | Ionomycin (calcium salt) 離子霉素 | 1 mg | 880元 |
BioGems | 1652981-1mg | Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA 佛波酯 | 1 mg | 880元 |
BioGems | 92110-00-150 | Permeabilization Buffer (10X) | 150 ml | 1030元 |
BioGems | 92160-00-160 | Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent | 160 ml | 420元 |
BioGems | 92550-00-50 | Transcription Factor Fixation/Permeabilizatio Concentrate | 50 ml | 1050元 |
流式方案BioGems*資料。
背景知識
TH1/TH2/TH17細胞[3]
Th細胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答主要參與者。傳統(tǒng)觀念根據(jù)Th細胞分泌的細胞因子不同將其分為兩型:一型能產(chǎn)生IFN-г的Th1細胞,在介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答中起重要作用;另一型能產(chǎn)生IL-4的Th2細胞,它們與體液免疫應(yīng)答有關(guān)。Th1/Th2細胞由共同前體細胞即CD4+T細胞分化而來,CD4+T細胞活化后,在IL-l2的作用下向Thl細胞分化。IL-l2是CD4+T細胞分化為Th1細胞的決定因子。IL-l2與IL-12R結(jié)合后誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和STAT4分子的活化,可上調(diào)IFN-г,進而活化STAT1分子,并誘導(dǎo)Th1細胞分化特異性地轉(zhuǎn)錄因子T-bet?;罨腃D4+T細胞在IL-4作用下向Th2細胞分化。
Th 17細胞是一型zui近發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞,主要分泌IL-17A(即IL-17),與炎性反應(yīng)和自身免疫疾病有關(guān)?;罨腃D4+T細胞在IL- 21或IL-6與TGF-β的共同作用下,經(jīng)STAT3通路激活視黃酸相關(guān)孤兒核受體(ROR)-гt和ROR-α,zui終分化為Th17細胞。
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)是一種佛波酯,常用于激活某些類型的蛋白激酶C(PKC),如group A (α, βI, βII, γ) 和group B (δ, ε, η, θ)異構(gòu)體。佛波酯(包括PMA)的結(jié)構(gòu)類似于二?;视?,可通過與PKC的C1域相互作用而活化PKC異構(gòu)體。通過PCK,PMA也活化某些MAP激酶途徑。PMA高濃度長時間作用于細胞可引起總PKC活性及其成瘤性的降低,而低濃度可能起保護作用。此外,PMA也促進造血分化。PMA的水溶性約是PDBu(phorbol-12,13-dibutyrate)的10倍,提示PMA更適合用于細胞學(xué)研究。
Ionomycin 離子霉素是Streptomyces conglobatus細菌生成的一種離子載體。用來提高胞內(nèi)鈣離子濃度,了解鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運機制。也可用于刺激以下胞內(nèi)因子產(chǎn)生:干擾素,穿孔素 ,IL-2和 IL-4,一般和佛波酯聯(lián)合使用。這些細胞因子在炎癥反應(yīng)中有重要作用。
Brefeldin A布雷菲爾德菌素A通過間接阻止COP-I與高爾基膜的連接,抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運。
引用
1 BioGems*資料
2 Wiki
3 《Th1、Th2、Th17和Treg研究現(xiàn)狀》 張文林
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