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液體活檢:血漿基因(DNA)保存、純化、文庫構(gòu)建和測序

更新時(shí)間:2018-01-26瀏覽:4094次

 

液體活檢是指非固體生物組織的取樣和檢測,來源一般是血液和尿液,對(duì)象包括血漿游離DNA/RNA、血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞和外泌體。與傳統(tǒng)的固體活檢相比,液體活檢技術(shù)可以無創(chuàng)取樣,并且能跟蹤檢測基因和生物標(biāo)志物。目前這種無創(chuàng)技術(shù)應(yīng)用于癌癥治療和產(chǎn)前篩查等。

 

液體活檢:無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(NIPT)

 

NIPT發(fā)展

NIPT應(yīng)用

NIPT檢測內(nèi)容

NIPT技術(shù)

 

 

 

 

NIPT發(fā)展

NIPT發(fā)展迅速,而且它還不是標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療項(xiàng)目,只是一個(gè)選擇項(xiàng)目。

NIPT發(fā)展快速得異常,消費(fèi)者在推進(jìn)??赡茉颍和缴缃幻襟w發(fā)展,討論較多。

NIPT應(yīng)用

NIPT在實(shí)際運(yùn)用中要解決的問題:

市場壓力

專業(yè)指南的快速變化。高風(fēng)險(xiǎn)孕婦和一般孕婦做咨詢用的時(shí)間都不一樣。那么獲得的信息也不同。孕婦查出有問題不一定要終止妊娠,還可以多做應(yīng)對(duì)準(zhǔn)備。而且做繼續(xù)懷孕決定的比例達(dá)到了40%。

NIPS在產(chǎn)前檢測中的準(zhǔn)確定位。一開始定位是高危產(chǎn)婦,之后不是高危產(chǎn)婦也對(duì)NIPT有興趣。中等風(fēng)險(xiǎn)妊娠群體的NIPT檢測,還會(huì)再上升。

NIPT的檢測

NIPT的檢測還不是準(zhǔn)確。

低風(fēng)險(xiǎn)用戶越多,PPV值越低。

生物學(xué)原因?qū)е碌哪阁w的miccroduplications也會(huì)影響檢測結(jié)果。

NIPT和標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)前檢測項(xiàng)目的比較

標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)前檢測項(xiàng)目:血清生化檢測和nuchal translucency超聲波檢查。

NIPT在在某些檢測方面的錯(cuò)誤率格外低,比如cfDNA陽性預(yù)測方面比標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目做得好。

NIPT的可選項(xiàng)目:性染色體

常規(guī)染色體非整倍體異常項(xiàng)目:21- 三 體 綜 合 征(trisomy 21,T21)、18-三體綜合征(trisomy 18,T18)和 13-三體綜合征(trisomy 13,T13)。

檢測可選項(xiàng)目:性染色體等。NIPT能比超聲波更早知道是否有性別染色體異常。

NIPT技術(shù)

美國NIPS的四個(gè)公司:4種技術(shù)。檢測錯(cuò)誤率差別較大。

Illumina:WGS 全基因組測序

Sequenom:WGS 全基因組測序

Ariosa Diagnostics:targeted approach on a microarray 微陣列靶向方法

Natera:targeted sequencing for SNP 靶向測序檢測單基因

 

液體活檢:腫瘤CTC和ctDNA

原發(fā)腫瘤(乳房、結(jié)腸、肺、前列腺癌)在形成生長早期,會(huì)釋放細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)。通過各種技術(shù)可以富集檢測這些循環(huán)腫瘤細(xì)胞的物理和生物性質(zhì)。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞,Circulating Tumor cell,簡稱CTC。CTC釋放點(diǎn):原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤。

CTC死亡后還會(huì)釋放出循環(huán)腫瘤DNA,Circulating Tumor DNA,簡稱ctDNA。

CTCs和ctDNA的分析是液體活檢診斷的基石。

CTC和ctDNA的臨床應(yīng)用

腫瘤檢測 CTCs和ctDNA應(yīng)用腫瘤的早期檢測很受關(guān)注,面臨的挑戰(zhàn)是目前分析的特定性和敏感度。

預(yù)后評(píng)估 多種腫瘤已經(jīng)實(shí)現(xiàn)預(yù)后評(píng)估,尤其是乳癌。

指導(dǎo)系統(tǒng)治療

病人亞群分類(stratification)。

CTC研究進(jìn)展

CTC研究是很活躍的領(lǐng)域,截止2015年12月發(fā)表在PubMed的文獻(xiàn)有17000篇。隨著循環(huán)游離腫瘤DNA分析的發(fā)展,zui近才開始使用“液體活檢”這個(gè)條目。分子水平的靈敏分析方便研究者從血漿中篩選特定腫瘤突變的ctDNA,因此ctDNA和CTC成為富有競爭力的生物標(biāo)志物。

 

 

 

 

液體活檢血漿DNA保存、純化、文庫構(gòu)建和測序產(chǎn)品(高通量測序法)

血液標(biāo)本采集、運(yùn)輸、保存

血漿游離DNA提取純化

血漿游離DNA基因文庫構(gòu)建

文庫產(chǎn)物純化

基因測序

 

外周血游離DNA標(biāo)本采集、運(yùn)輸、保存

外周血血漿游離DNA采集:EDTA 抗凝管或者 Streck Cell-Free DNA BCT 管

 

 

Streck Cell-Free DNA BCT® 血漿游離DNA采血管

產(chǎn)品英文名稱:Streck Cell-Free DNA BCT® BLOOD COLLECTION TUBE

產(chǎn)品中文名稱:Streck BCT® 血漿游離DNA采血管

Streck 血漿游離DNA采血管是一種直接提取的全血收集管,用于收集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存血液樣本。Streck 血漿游離DNA采血管內(nèi)含防腐劑,它能穩(wěn)定有核血細(xì)胞,防止細(xì)胞基因組DNA的釋放,保護(hù)血漿游離循環(huán)DNA和循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。

230253是218962的升級(jí)版,是Streck公司新推將玻璃和塑料的*性能融合在一起的Fusion2TM混合塑料管。

         

品牌

貨號(hào)

產(chǎn)品描述

包裝

Streck

218962

Cell-Free DNA BCT® BLOOD COLLECTION TUBE

Cell-Free DNA BCT®血漿游離DNA采血管

100管/盒

Streck

230253

Cell-Free DNA BCT® BLOOD COLLECTION TUBE

Cell-Free DNA BCT®血漿游離DNA采血管(混合塑料)

100管/盒

 

EDTA抗凝管參見BD真空采血管分類 血清 血漿 單個(gè)核細(xì)胞 RNA 肝素 EDTA

 

血漿游離DNA提取純化

磁珠法或離心柱法

離心柱法產(chǎn)品:

QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 循環(huán)核酸純化試劑盒

貨號(hào): 55114 品牌:Qiagen

QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (50)

For 50 preps: QIAamp Mini Columns, Tube Extenders (20 ml), QIAGEN Proteinase K, Carrier RNA, Buffers, VacConnectors, and Collection Tubes (1.5 ml and 2 ml)

樣品處理量:5mL

洗脫體積:20-150μL

可以洗去PCR抑制物,如:二價(jià)陽離子和蛋白

 

血漿游離DNA文庫構(gòu)建

ThruPLEX® Plasma-seq Kit血漿游離DNA文庫構(gòu)建試劑

ThruPLEX® Plasma-seq基于ThruPLEX技術(shù),并用于血漿來源cfDNA高品質(zhì)NGS文庫構(gòu)建。該試劑專門針對(duì)cfDNA進(jìn)行優(yōu)化,在保持樣本GC代表性的基礎(chǔ)上,提升了文庫的信息容量。文庫構(gòu)建后可用于CNV分析、全基因組測序分析或是采用一些panel針對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲富集后的DNA分析,如Agilent SureSelect® and Roche NimbleGen SeqCap® EZ。

血漿樣品采用ThruPLEX Plasma-seq試劑盒制備文庫,能有更好的靈敏度、更準(zhǔn)確的基因變異分析結(jié)果。與其它液態(tài)活檢的樣品一樣,血漿由于其易獲得、價(jià)值高的特點(diǎn),深受研究腫瘤學(xué)或者孕婦血漿中胎兒游離DNA科研工作者的重視。

 

品牌

Code No.

包裝量

Rubicon

R400490

12 Rxns

Rubicon

R400491

48 Rxns

Rubicon

R400492

96 Rxns

 

 

文庫產(chǎn)物純化

Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒

Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒是一種能夠獲得高質(zhì)量DNA產(chǎn)物的純化試劑盒,純化后的核酸純度高,無鹽離子殘留,無需離心或過濾,目前廣泛應(yīng)用于NGS文庫構(gòu)建。該試劑的應(yīng)用為產(chǎn)物純化,如:NGS文庫構(gòu)建過程中酶聯(lián)體系的純化、PCR產(chǎn)物純化等。既可以手工操作,也可以使用自動(dòng)化工作平臺(tái)以96孔或384孔板的形式完成。

 

品牌

貨號(hào)

產(chǎn)品名稱

包裝

BeckMan

A63882

Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒

450 mL

 

 

基因測序

illumina 基因測序試劑盒

參考文獻(xiàn)

1.吳一龍,等. 液體活檢:規(guī)范與同行.循證醫(yī)學(xué)2016年04期,P193-197.

2.Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy,

Catherine Alix-Panabières,Cancer Discov;6(5); 479–91. ©2016 AACR Published OnlineFirst March 11, 2016; DOI: 10.1158/2159-8290.CD-15-1483.

 

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