1、常用玻璃儀器的準(zhǔn)備
制備培養(yǎng)基所用的吸管、錐形瓶、毛細(xì)吸管、平皿等玻璃儀器用前要用肥皂水洗刷后用清水沖洗干凈,晾干后備用。
(1)試管管口用棉花塞或硅氟塑料試管塞塞好,再用布或報紙包扎好,121℃高壓蒸汽滅菌20℃后烘干,備用。
(2)吸管及滴管先用少許棉花塞于吸口端(防止污染物吸出,或橡皮帽內(nèi)的氣體污染),然后用紙包后或裝入金屬吸管筒內(nèi),于121℃高壓蒸汽滅菌20min后烘干,備用。其他玻璃器皿均應(yīng)按上法處理,也應(yīng)裝金屬筒內(nèi)160℃干熱滅菌2h后,備用。
(3)平皿用紙或布包好,或裝在金屬盒內(nèi),于121℃高壓蒸汽菌3min后烘干,備用。
2、培養(yǎng)基的制備及儲存
(1)溶化:一般應(yīng)放在玻璃器皿或搪瓷齊內(nèi)。加入蒸餾水,隔水加熱以促其溶解,加熱時應(yīng)經(jīng)常攪拌,防止焦結(jié),待其溶解后補足水分。
在使用干燥培養(yǎng)基時,先將蒸餾水按定量加入容器中,然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉放入水中,靜置10—15min,攪拌,振蕩,或延長時間以促進溶解,一般不要熱,必要時加熱,但時間不宜過長,溫度不宜過高,避免某些營養(yǎng)成分被破壞。
(2)校正酸堿度(調(diào)節(jié)pH):培養(yǎng)基必須有適當(dāng)?shù)膒H。因此測定pH是培養(yǎng)基配制過程中的重要步驟之一,測定pH的標(biāo)準(zhǔn)溫度為25士2℃。調(diào)節(jié)pH可用無菌的1mol/l氫氧化鈉溶液或10%碳酸鈉溶液、1mol/l鹽酸溶液。當(dāng)調(diào)節(jié)緩沖液的pH時,宜用6mol/l磷酸或10mol/l氫氧化鉀溶液。滅菌后的pH會比滅菌前的pH升高或降低,一般高壓滅菌前培養(yǎng)基的pH會比終pH調(diào)高0.2左右,滅菌后基本合適。因此對培養(yǎng)基、緩沖液、試劑在滅菌前后的pH均進行測定,并記下每次pH的測定結(jié)果,有助于積累數(shù)據(jù)考察每種培養(yǎng)基、緩沖液、試劑對滅菌程序的耐受性,從而指導(dǎo)滅菌前pH的調(diào)節(jié)。干燥培養(yǎng)基一般已校正過pH,用時也必須再驗證。測定時,一般用指示劑滴入培養(yǎng)基觀察其顏色的變化,或用pH計校正,如與所需pH不符,可用以上的酸或堿液加以校正。調(diào)整pH后要加熱過濾,使培養(yǎng)基澄清。
(3)培養(yǎng)基的分裝:大批量配制時使用的自動分配器須經(jīng)校準(zhǔn)和確認(rèn)。每次使用前后,均要對分配器的管道系統(tǒng)進行沖洗,在分裝無菌培養(yǎng)基前,則要采用無菌硅膠管。
固體培養(yǎng)基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中,高壓滅菌后根據(jù)需要分裝平皿或試管。
平皿:傾注平皿,應(yīng)在無菌室中放置3—4h,如用塑料平皿須在35℃培養(yǎng)箱 中倒置30—60min。讓水蒸汽自然蒸發(fā)。
斜面:制備低層斜面分裝于試管,約占容積1/5,滅菌后趁熱斜放在細(xì)玻璃棒和木桿上,使成斜度,分裝使注意管口和瓶塞上勿沾有培養(yǎng)基,如沾有培養(yǎng)基應(yīng)用布抹去,以避免污染。
高層斜面:制備高層斜面分裝于試管,約占試管容積的1/3,滅菌后趁熱放置成高層短斜面,待其凝固后應(yīng)用。
分裝好的培養(yǎng)基或緩沖液等及時密封后必須在配制當(dāng)天(2h內(nèi))進行滅菌處理。液體、半固體培養(yǎng)基一般在高壓滅前分裝,約裝試管容積的1/3,在滅菌后還要加其他成分的液體、半固體培養(yǎng)基,滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。
培養(yǎng)基的滅菌:培養(yǎng)基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌,各種培養(yǎng)基的滅菌時間和壓力,按其成分不同而定。普通培養(yǎng)基采用121℃、103.42kPa滅菌15min,但容器和裝量較大時,應(yīng)延長至20min。含糖培養(yǎng)基115℃、68.85kPa滅菌30min。含糖、血清、雞蛋等培養(yǎng)基可用流動蒸汽及血清凝固器80—100℃、30min,連續(xù)3d,間歇滅菌。血清或組織液,采用低熱56—58水浴1h,連續(xù)5—6d滅菌,一些遇高溫即被破壞的物質(zhì)如尿素、腹水等,可用細(xì)菌過濾器,過濾除菌。高壓滅菌應(yīng)嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行,必須逐漸加熱,*排除滅菌器內(nèi)的空氣,再逐漸升壓保持預(yù)定的壓力和時間,達到全部殺滅微生物。以上的滅菌時間和溫度要經(jīng)過驗證確認(rèn),如不同類型培養(yǎng)基混合一起滅菌時宜采用115℃、68.85kPa滅菌30min為好。