介紹
可變長度的DNA(DNA探針)能夠與互補的核酸鏈形成非共價、高度特異的雙鏈(稱為雜交)。當一個標簽附加到這樣一個雜交探針的檢測可以有效地服務于定義目標DNA序列標記DNA探針通常用于原位雜交實驗研究和臨床診斷特定染色體的DNA序列,以及潛在的畸變(突變。缺失和/或重復)被檢測到并定位在固定的組織和細胞內。
原位DNA的可視化要么通過熒光讀數(熒光原位雜交(FISH))，要么通過顯色檢測(顯色原位雜交(CISH))，這依賴于酶促反應導致有顏色的底物沉淀。
原位雜交中對DNA探針的標記通常是使用標記DNA聚合酶(=聚合酶鏈反應(PCR))或DNA酶I/ DNA聚合酶1的混合物(-NT)(表1)
表1原位雜交DNA探針可通過Nick Translation或PCR酶標
| Nick Translation | PCR | |
| 原則 | DNA酶 I在dsDNA中引入隨機單鏈斷裂('nicks ')，隨后由DNA聚合酶I填充，使用標記的dNTP作為其天然配對物的替代物 | 一段特定DNA的擴增(用特定引物或多段DNA進行PCR)利用Taq聚合酶摻入標記的dNTP取代其自然對應物的位點(用退化寡核苷酸引物進行PCR (dopo -PCR)) |
| 模板 | 線性化的dsDNA的pmol量 | 線性化的dsDNa的fmol數量 |
| 標記片段大小 | 100–500 bp dsDNA | up to 1500 bp |
| 擴增 | 否 | 是 |
熒光dUTP & dCTP
熒光dUTP和dCTP可用于酶促標記DNA探針一步完成。標記后的DNA探針可通過熒光顯微鏡或光譜直接顯示。組合標記，例如用不同或*的熒光團標記探針，允許同時顯示多個目標(多路復用)41熒光團的選擇取決于可用的激發(fā)源、濾光片組、應用(單色或多色成像)(表2)和所需的酶標技術(Nick Translation或PCR)(表3)。
熒光團的光穩(wěn)定性和親水性都是決策時需要考慮的關鍵參數。例如，光穩(wěn)定性提高的熒光團一般可以增加靈敏度，從而提高目標序列的檢測極限。然而，熒光團的親水性直接影響相應標記的dUTP和dCTP的基材性能用親水(如Cy3)或中度疏水染料(如德州紅)標記的dUTP和dCTP是PCR和Nick翻譯標記的理想選擇。相反，疏水熒光載體(如ATTO0647N)會導致DNA擴增的提前終止，很可能是由于染料-dve或染料-酶的相互作用，因此僅推薦用于Nick Translation。
表2所選熒光染料的光譜特性。++:好，+:中等，-:poon請注意:呋酚的性能取決于呋酚的應用，呋酚是親水性和光穩(wěn)定性之間的一種承諾，這分別決定了親水性和光穩(wěn)定性的親水性和檢測靈敏度。
表3酶合成的熒光dUTP和dCTP。n / a:不適用
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