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細(xì)胞培養(yǎng)常見問題分析解決

更新時(shí)間:2022-06-06瀏覽:1350次

細(xì)胞污染  
凡是對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有危害的成分或者造成細(xì)胞不純的異物都視為污染。細(xì)胞污染根據(jù)污染源可以分為化學(xué)污染,物理污染和生物污染。  
化學(xué)污染  
細(xì)胞培養(yǎng)所用到的培養(yǎng)基,水要高壓蒸汽鍋滅菌。其中,血清作為細(xì)胞培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基,血清存在潛在的化學(xué)污染,此外血清成分具有不確定性,血清對(duì)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)影響包括毒副作用等存在差異。  
物理污染  
物理污染,主要指放射線、溫度、振動(dòng)、輻射等物理因素對(duì)細(xì)胞的破壞。如將細(xì)胞液培養(yǎng)基等暴露于放射線或紫外線下,會(huì)引起細(xì)胞代謝改變。恒溫培養(yǎng)箱的周圍存在能夠產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)的設(shè)備,可能也會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)存在一定影響。  
微生物污染  
1.細(xì)菌:細(xì)菌污染常見的有大腸桿菌,葡萄球菌等。細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn),在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀,培養(yǎng)液一般會(huì)在短時(shí)間內(nèi)變黃,有時(shí)靜置的培養(yǎng)液不混,稍加震蕩,變會(huì)有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮,有時(shí)在細(xì)胞表面及周圍有大量細(xì)菌存在,細(xì)胞停止生長(zhǎng)并有中毒表現(xiàn)。  
處理:  
在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的抗生素,能夠預(yù)防絕大多數(shù)的細(xì)菌污染  
保證器皿、水充分滅菌,空氣無菌,同時(shí)保證滅菌壓力。  
2、霉菌:霉菌的污染多數(shù)是白色念珠菌,曲霉菌,酵母菌等。霉菌污染后培養(yǎng)液短期內(nèi)依舊清亮不變渾濁,倒置顯微鏡下可看見細(xì)胞之間有交錯(cuò)的絲狀,樹枝狀菌絲,漂浮在培養(yǎng)液中。念珠菌呈卵圓狀,在細(xì)胞周邊生長(zhǎng)。細(xì)胞被霉菌污染后,仍可生長(zhǎng),長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞的活力狀態(tài)會(huì)變差。  
處理:先確定污染物的種類:細(xì)菌、真菌還是支原體。如果是霉菌污染。迅速將污染細(xì)胞與正常細(xì)胞系隔離,并對(duì)實(shí)驗(yàn)中所用過的所有器皿工具消毒  
3、支原體:支原體的大小介于細(xì)菌和病毒之間,是一種獨(dú)立生活的微生物。對(duì)熱敏感,對(duì)一般抗生素不敏感。支原體的形態(tài)多變,多吸附在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。電鏡下觀察,中心有高密度的密集顆粒,橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似。  
因國內(nèi)的血清很多數(shù)都沒有做支原體陰性檢測(cè),而支原體又是牛血清中最常見的微生物之一。支原體污染細(xì)胞后,培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁.但細(xì)胞變化不顯著,在細(xì)胞逐漸的培養(yǎng)中,細(xì)胞會(huì)慢慢死亡。  
支原體污染檢測(cè):  
熒光染色法:DNA和與DNA特異性結(jié)合的熒光染料結(jié)合,使得支原體的DNA著色,然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。  
解決:  
1.抗生素排除法:支原體污染預(yù)防比解決好。如果不小心污染后,可加入高濃度抗生素(常規(guī)使用的5倍濃度)作用24-48小時(shí),再換入常規(guī)培養(yǎng)液,但該法不保證有效。推薦用量:慶大霉素200ug/ml,四環(huán)素10ug/ml,卡那霉素50ug/ml。  
2.加溫除菌:支原體不耐熱,可以對(duì)支原體污染的細(xì)胞熱處理除菌。將支原體污染的細(xì)胞放置41度中作用10小時(shí)可殺死支原體。因高溫對(duì)細(xì)胞本身也會(huì)產(chǎn)生一定影響,故熱處理前需先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),確定對(duì)細(xì)胞影響最小而能大程度的殺死支原體的時(shí)間。  
4、黑蛟蟲:黑膠蟲污染后細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點(diǎn),高倍鏡下可看見不規(guī)則的運(yùn)動(dòng)。培養(yǎng)液渾濁不明顯,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)無太大影響。  
解決:如果細(xì)胞出現(xiàn)黑膠蟲污染,可增加細(xì)胞的接種密度,提高細(xì)胞存活率。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)很好時(shí),黑膠蟲的數(shù)量會(huì)降低。細(xì)胞培養(yǎng)過程中堅(jiān)持要每天換液,并用緩沖液沖洗,能夠大大降低黑膠蟲的數(shù)量,可最終消失,偶爾在鏡下可見個(gè)別小黑點(diǎn),但整體細(xì)胞培養(yǎng)和后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染無影響。  
細(xì)胞培養(yǎng)箱染菌清洗方法  
用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內(nèi),再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅?;蛘咴谂囵B(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。  
CO2孵箱被霉菌污染后,可把所有細(xì)胞暫時(shí)轉(zhuǎn)移,采用過氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板,箱壁)。并把過氧乙酸放置在孵箱內(nèi)一個(gè)小時(shí),使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后,再移入細(xì)胞。孵箱應(yīng)定期清潔(2月左右)。  
其它培養(yǎng)箱清洗方法是:用84液擦洗-清水擦洗-75%酒精擦洗-紫外燈照。  
預(yù)防霉菌污染,可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線或雙抗;但細(xì)胞一旦污染,制霉菌素或放線或雙抗都無法彌補(bǔ),舍棄被污染細(xì)胞,并將環(huán)境*消毒。如果所有細(xì)胞都污染,可能是整體系統(tǒng)污染,檢查所有培養(yǎng)基和器材,并重新滅菌。針對(duì)個(gè)別污染,首先考慮操作問題,注意操作規(guī)范。