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細(xì)胞轉(zhuǎn)染小貼士

更新時(shí)間:2024-12-05瀏覽:853次

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA,RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展,轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗(yàn)中,其應(yīng)用越來(lái)越廣泛。影響轉(zhuǎn)染效率的因素有很多,細(xì)胞株本身的特性和活性,細(xì)胞培養(yǎng)條件,轉(zhuǎn)染的DNA或RNA的質(zhì)量,轉(zhuǎn)染方法,轉(zhuǎn)染試劑的選擇等。
轉(zhuǎn)染效率受多種因素影響,主要因素有下面幾個(gè):
1.轉(zhuǎn)染試劑
不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同,但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要,因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。當(dāng)然,zui shi he的是高效、低毒、方便、廉價(jià)的轉(zhuǎn)染試劑。
2.細(xì)胞狀態(tài)
一般低的細(xì)胞代數(shù)(<50)能確?;蛐筒蛔儭ui shi he轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,最容易轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。
3.轉(zhuǎn)染方法
轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)跟據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法,但也要注意,因不同實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的細(xì)胞性質(zhì)不同,質(zhì)粒定量差異,操作手法上的差異等,其轉(zhuǎn)染效果可能不同,應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體條件來(lái)確定好的轉(zhuǎn)染條件。
(1)細(xì)胞培養(yǎng)物
不同細(xì)胞有不同的培養(yǎng)基,血清和添加物。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度,一般的轉(zhuǎn)染試劑都會(huì)有專門的說(shuō)明。推薦在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)分細(xì)胞,這將提供正常細(xì)胞代謝,增加對(duì)外源DNA攝入的可能。一定要避免細(xì)菌,支原體或真菌的污染。
(2)細(xì)胞密度
不同的轉(zhuǎn)染試劑,要求轉(zhuǎn)染時(shí)的最適細(xì)胞密度各不相同,即使同一種試劑,也會(huì)因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑,最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)并為以后的實(shí)驗(yàn)建立一個(gè)穩(wěn)定方法,包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等等。陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù),有的要求細(xì)胞90%匯片;而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%-80%之間,總之是盡導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。
(3)血清
轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天,對(duì)于主流的轉(zhuǎn)染試劑來(lái)說(shuō),血清的存在已經(jīng)不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率,甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率,如陽(yáng)離子聚合物等,血清的存在會(huì)影響DNA一轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成,但只要在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基或PBS來(lái)稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑就可以了,在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。不過要特別注意:對(duì)于RNA轉(zhuǎn)染,如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。胎牛血清(FCS)經(jīng)常用到,便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。
(4)抗生素
目前轉(zhuǎn)染試劑因?yàn)槿潭伎梢杂糜醒搴涂股氐忍砑觿┑?培養(yǎng)基來(lái)操作,非常方便,省去了污染等麻煩。
(5)氮磷(N/P)比
N/P比是轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵(為了換算方便,一般以DNA/轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量比表示),在一定比例范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染效率隨N/P比成比例增高,之后達(dá)到平值,但毒性也隨之而增加,因此在實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)根據(jù)推薦比例,確定本實(shí)驗(yàn)好的轉(zhuǎn)染比例。
(6)DNA質(zhì)量
DNA質(zhì)量對(duì)轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)(如脂質(zhì)體等)基于電荷吸引原理,如果DNA不純,如帶少量的鹽離子,蛋白,代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。
4.載體構(gòu)建
轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建(病毒載體,質(zhì)粒.DNA,RNA,PCR產(chǎn)物,寡核苷酸等)也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。病毒載體對(duì)特定宿主細(xì)胞感染效率較高,但不同病毒載體有其特定的宿主,有的還要求特定的細(xì)胞周期,如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細(xì)胞,此外還需考慮一些安全問題(如基因污染)。除載體構(gòu)建外,載體的形態(tài)及大小對(duì)轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響,如前面提到的超螺旋及線性DNA對(duì)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性作用,轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行,因此選擇組成或可調(diào)控,強(qiáng)度合適的啟動(dòng)子也很重要,同時(shí)做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對(duì)照可排除毒性影響的干擾。