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技術(shù)支持

RNA-seq測序原理
更新時間:2024-07-29   點擊次數(shù):173次

RNA-seq及其分析是近年來最火的研究方向之一,想要詳細了解RNA-seq的原理,最好先自行了解一下在此之前的各種測序技術(shù),下面給出了測序技術(shù)的大致發(fā)展歷程。

測序技術(shù)發(fā)展:

1977Sanger測序--1996焦磷酸測序--2003cmPCR--2003ZMW---2012納米孔測序--now第二代測序(NGS)

第一代測序技術(shù)(Sanger測序)雖然有測序讀長(可達1000bp)、測序準(zhǔn)確率(高達99.999%)的優(yōu)點,但是其測序成本高、通量(儀器一次測序產(chǎn)生的總數(shù)據(jù)量)低等缺點導(dǎo)致無法大規(guī)模應(yīng)用。

第二代測序技術(shù)(NGS)有測序速度快、測序成本低、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點,但其測序讀長比第一代測序技術(shù)要短很多(一般100-150bp)。目前illumina是NGS的主流公司(采用Hisq技術(shù)),其儀器的方法都是邊合成邊測序。

RNA-seq(RNA sequencing)是一種利用高通量測序技術(shù)來測定RNA樣本的方法,它可以提供關(guān)于轉(zhuǎn)錄組的詳細信息,包括mRNA、microRNA、lncRNA等不同類型的RNA分子的表達水平、剪接變異、融合轉(zhuǎn)錄本以及新的轉(zhuǎn)錄本等。以下是RNA-seq的基本步驟和技術(shù)原理:

  1. 樣本準(zhǔn)備

    • 總RNA提取:首先從樣本中提取出總RNA,這一步通常需要使用商業(yè)化的RNA提取試劑盒。

    • rRNA去除:由于rRNA在總RNA中占比很大,因此通常需要去除rRNA以提高后續(xù)測序的效率。這可以通過多種方法完成,例如使用特異性引物的寡聚dT磁珠捕獲poly(A)+ mRNA或使用rRNA特異性探針進行雜交捕獲。

  2. cDNA文庫構(gòu)建

    • 反轉(zhuǎn)錄:使用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)換成cDNA。

    • 文庫片段化:如果需要,可以通過超聲波或酶處理將cDNA片段化。

    • 接頭連接:在cDNA片段的兩端加上測序接頭,以便于后續(xù)的測序過程。

    • PCR擴增:通過PCR擴增文庫,增加文庫的拷貝數(shù),同時也可以在此步驟中引入索引(index)以便進行多重測序。

  3. 測序

    • 使用高通量測序平臺(如Illumina、Thermo Fisher的Ion Torrent或PacBio等)對文庫進行測序。目前最·常用的測序技術(shù)是基于Illumina平臺的短讀長測序,可以產(chǎn)生幾十到幾百堿基長度的序列片段。

  4. 數(shù)據(jù)處理和分析

    • 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控:對原始的測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制,去除低質(zhì)量的reads。

    • 序列比對:將測序得到的reads與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組比對,確定它們在基因組中的位置。

    • 表達量化:根據(jù)比對結(jié)果,計算每個基因或轉(zhuǎn)錄本的表達水平,常用的方法有FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads) 或TPM (Transcripts Per Million)。

    • 差異表達分析:比較不同條件下的樣本,找出差異表達的基因。

    • 其他高級分析:還可以進行剪接變異檢測、新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測、非編碼RNA分析等。

整個RNA-seq流程涵蓋了從樣本處理到數(shù)據(jù)分析的多個步驟,每一環(huán)節(jié)都需要細致的操作和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)處理。隨著技術(shù)的發(fā)展,RNA-seq已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄組研究中不·可·或缺的工具,廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域。


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