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QIAGEN REPLI-g Mini Kit 全基因組擴(kuò)增試劑

用于從小或珍貴樣品中進(jìn)行高度均一的全基因組擴(kuò)增

• 易于擴(kuò)增，產(chǎn)量高達(dá)10μg
• 基因組基因座的無(wú)偏差擴(kuò)增
• 多位移放大（MDA）帶來(lái)可靠的結(jié)果
• 擴(kuò)增的DNA非常適合大多數(shù)下游應(yīng)用
• 長(zhǎng)期儲(chǔ)存期間沒(méi)有DNA降解的風(fēng)險(xiǎn)

       REPLI-g Mini Kit使用創(chuàng)新的多位移擴(kuò)增（MDA）技術(shù)，從小樣品中提供優(yōu)化的全基因組擴(kuò)增試劑（WGA）。50μl反應(yīng)的典型DNA產(chǎn)量高達(dá)10μg，平均產(chǎn)物長(zhǎng)度大于10kb（范圍在2kb和100kb之間）。*的REPLI-g技術(shù)可從各種小型或珍貴樣品中提供高度均一的WGA，包括純化的基因組DNA，或直接來(lái)自新鮮或干燥的血液，口腔拭子，新鮮或冷凍組織和細(xì)胞。這種簡(jiǎn)單可靠的方法能夠?qū)蚪M進(jìn)行準(zhǔn)確和無(wú)偏的擴(kuò)增，并生成DNA，無(wú)需進(jìn)一步純化或定量即可應(yīng)用于不需要標(biāo)記的下游應(yīng)用。與基于PCR的WGA技術(shù)相比，

性能

來(lái)自各種樣品的高產(chǎn)量，適用于多種應(yīng)用

      使用REPLI-g Mini Kit，可以使用各種臨床和非臨床研究樣本，包括基因組DNA，新鮮或干燥的血液，新鮮或冷凍組織和細(xì)胞。每50μl反應(yīng)的典型DNA產(chǎn)量始終達(dá)到10μg，而無(wú)論模板DNA的數(shù)量如何，通常都能獲得均一的擴(kuò)增DNA產(chǎn)量。從不同的模板濃度獲得均勻的DNA產(chǎn)量始終是重要的，但對(duì)于高通量應(yīng)用尤其重要，這需要隨后的遺傳分析，而無(wú)需額外測(cè)量或調(diào)整DNA濃度。

      REPLI-g擴(kuò)增DNA的平均產(chǎn)物長(zhǎng)度通常大于10kb，范圍在2kb和100kb之間，使得能夠進(jìn)行下游應(yīng)用，例如復(fù)雜的限制酶分析和長(zhǎng)程PCR。REPLI-g擴(kuò)增的DNA非常適用于基因分型應(yīng)用，例如使用TaqMan®引物/探針組進(jìn)行SNP基因分型，測(cè)序和STR /微衛(wèi)星分析。

成功用于下一代測(cè)序

      許多出版物已經(jīng)證明REPLI-g擴(kuò)增DNA成功應(yīng)用于下一代測(cè)序（NGS）應(yīng)用，包括從腫瘤細(xì)胞的外顯子組和全基因組測(cè)序，到宏基因組學(xué)研究，到單細(xì)胞分析（對(duì)于一系列近期出版物而言）在NGS中成功使用REPLI-g，請(qǐng)參閱我們的WGA資源頁(yè)面）。由于使用全基因組擴(kuò)增的DNA用于NGS和陣列應(yīng)用已經(jīng)引起爭(zhēng)議，我們檢測(cè)到可能影響使用擴(kuò)增DNA用于這些下游應(yīng)用的成功的潛在因素。我們確定輸入材料的質(zhì)量強(qiáng)烈影響下游NGS實(shí)驗(yàn)的成功。如果使用低質(zhì)量DNA（例如，降解的DNA）或老化的組織材料，所得到的擴(kuò)增的DNA可能不會(huì)給出可靠的結(jié)果（數(shù)據(jù)未顯示）。然而，使用REPLI-g技術(shù)的WGA在完整細(xì)胞或未降解的純化DNA上顯示NGS結(jié)果與用純化的gDNA獲得的結(jié)果相當(dāng)?；蚪M基因座序列的序列覆蓋和比對(duì)比較表明WGA后的垃圾DNA水平小化，而擴(kuò)增和基因組DNA的錯(cuò)誤率在相似的百分比范圍內(nèi)。

高保真全基因組擴(kuò)增

      REPLI-g技術(shù)在整個(gè)基因組中提供高度均一的DNA擴(kuò)增。Phi29聚合酶可復(fù)制高達(dá)70kb而不與基因組DNA模板解離。與基于PCR的全基因組擴(kuò)增（WGA）技術(shù)相比，Phi29聚合酶具有3'→5'核酸外切酶校正活性，并且在復(fù)制期間與Taq DNA聚合酶相比保持高達(dá)1000倍的保真度。試劑盒中提供的外切核酸酶抗性引物可確保高產(chǎn)量的DNA產(chǎn)物，WGA緩沖系統(tǒng)針對(duì)非常長(zhǎng)的閱讀長(zhǎng)度和無(wú)偏的基因座表現(xiàn)進(jìn)行了優(yōu)化。

REPLI-g優(yōu)于基于PCR的WGA方法

      傳統(tǒng)的基因組DNA擴(kuò)增方法包括創(chuàng)建EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的耗時(shí)過(guò)程，然后使用隨機(jī)或簡(jiǎn)并寡核苷酸引發(fā)的PCR進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。此外，如其他供應(yīng)商通常使用的基于PCR的方法（例如，DOP-PCR和PEP）可以產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增假象并且給出基因座的不*覆蓋。在一些情況下，可能產(chǎn)生小于1kb長(zhǎng)的DNA，其不能用于許多下游應(yīng)用中。通常，由于使用低保真酶Taq，產(chǎn)生的DNA具有高得多的突變率DNA聚合酶，可導(dǎo)致容易出錯(cuò)的擴(kuò)增，導(dǎo)致例如單堿基對(duì)突變，STR收縮和擴(kuò)增。與這些缺點(diǎn)相反，REPLI-g在整個(gè)基因組中提供高度均一的擴(kuò)增，在擴(kuò)增過(guò)程中具有小的基因座偏差和小的突變率（參見(jiàn)“ 使用REPLI-g技術(shù)的高度代表性擴(kuò)增 ”和“ *且準(zhǔn)確的全基因組擴(kuò)增 ”） ）。

原理

      *的REPLI-g技術(shù)使用創(chuàng)新的高保真酶Phi 29聚合酶，使用多重置換擴(kuò)增（MDA）和溫和的堿性變性步驟擴(kuò)增復(fù)雜的基因組DNA，以均勻地?cái)U(kuò)增基因組位點(diǎn)。REPLI-g Mini Kit的典型產(chǎn)量高達(dá)10μg，可以根據(jù)您的需要使用REPLI-g Midi Kit輕松按比例縮小，因?yàn)閮煞N試劑盒都基于相同的方案并使用相同的反應(yīng)體積。簡(jiǎn)單的反應(yīng)設(shè)置和約15分鐘的極低處理時(shí)間使得REPLI-g成為一種簡(jiǎn)單可靠的方法，當(dāng)需要有限或珍貴樣品的完整和無(wú)偏的軌跡表示時(shí)。

放大原理

      REPLI-g使用等溫基因組擴(kuò)增，稱(chēng)為多位移擴(kuò)增（MDA），其涉及隨機(jī)六聚體與變性DNA的結(jié)合，然后使用酶Phi29聚合酶在恒定溫度下進(jìn)行鏈置換合成。在用作模板的每個(gè)置換鏈上發(fā)生另外的引發(fā)事件，使得能夠產(chǎn)生高產(chǎn)量的擴(kuò)增DNA。Phi 29聚合酶是一種噬菌體衍生酶，是一種具有3'→5'主要核酸外切酶活性（校對(duì)活性）的DNA聚合酶，與Taq相比，其保真度高達(dá)1000倍。DNA聚合酶。在*，優(yōu)化的REPLI-g緩沖系統(tǒng)的支持下，Phi 29聚合酶可輕松解決二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾環(huán)，從而防止聚合酶在擴(kuò)增過(guò)程中滑脫，停止和解離。這使得能夠產(chǎn)生高達(dá)100kb的DNA片段而沒(méi)有序列偏。

DNA的堿性變性

      基因組DNA在用于酶擴(kuò)增程序之前必須變性，這通常使用苛刻的方法完成，例如在升高的溫度下孵育（加熱孵育）或增加的pH（化學(xué)堿性孵育）。REPLI-g Midi Kit使用溫和的堿性孵育，允許均勻的DNA變性，DNA碎片非常低或產(chǎn)生無(wú)堿基位點(diǎn)。這導(dǎo)致擴(kuò)增的DNA具有非常高的完整性，并使擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度大化，從而均勻地表示基因組基因座和序列。使用REPLI-g Mini Kit，可確保在后續(xù)下游應(yīng)用中獲得可靠的結(jié)果，而不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性或陰性數(shù)據(jù)，這與其他使用熱誘導(dǎo)變性的WGA技術(shù)不同，后者會(huì)損害模板DNA，從而導(dǎo)致偏向和代表性不足的位點(diǎn)

程序

簡(jiǎn)單，一管程序

      REPLI-g Mini Kit使用簡(jiǎn)單可靠的方法從少量分離的靶基因組DNA或直接從全血，干血卡，血沉棕黃層和組織培養(yǎng)細(xì)胞中獲得準(zhǔn)確的基因組擴(kuò)增。加入裂解緩沖液，裂解樣品材料并使DNA變性，然后進(jìn)行短時(shí)間的孵育。中和后，加入預(yù)混合物（包括REPLI-g Mini DNA聚合酶），等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在30℃下進(jìn)行過(guò)夜。REPLI-g擴(kuò)增的DNA可以在-20°C下長(zhǎng)期保存，沒(méi)有負(fù)面影響。

應(yīng)用

REPLI-g擴(kuò)增基因組可用于多種下游應(yīng)用，包括：

• 使用TaqMan®引物/探針組進(jìn)行SNP基因分型
• 基于qPCR和PCR的突變檢測(cè)
• 新一代測(cè)序
• STR /微衛(wèi)星分析
• 桑格測(cè)序
• RFLP和Southern印跡分析
• 陣列技術(shù)，如比較基因組雜交 

QIAGEN REPLI-g Mini Kit 全基因組擴(kuò)增試劑

QIAGEN REPLI-g Mini Kit產(chǎn)品訂購(gòu)信息

 品牌                         產(chǎn)品貨號(hào)                 產(chǎn)品名稱(chēng)                

QIAGEN                    150023              REPLI-g Mini Kit （25）          

QIAGEN                    150025              REPLI-g Mini Kit （100）

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