實驗簡介：
    細胞培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)建于1907年，歷經(jīng)一個世紀磨練與升華，現(xiàn)已成為自然科學(xué)領(lǐng)域*的研究方法之一。小伙伴們要想在如今細胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛滲透的科學(xué)研究領(lǐng)域搞好科研，最基礎(chǔ)的細胞株的冷凍保存和解凍復(fù)蘇技術(shù)自然不能忽視。
    細胞凍存是將細胞放在低溫環(huán)境，減少細胞代謝，以便長期儲存的一種技術(shù)。細胞凍存是細胞保存的主要方法之一，起到了細胞保種的作用。

實驗前準備： 
1.材料準備：

     生長良好之培養(yǎng)細胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、等速降溫機

2.冷凍方法理論準備:

   (1)傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-8O℃16~18小時(或隔夜)--->液氮槽長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-8O℃冰箱中。
     (2）程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-8o℃以下) -120℃，再放在液氮槽長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。

實驗步驟：

細胞凍存步驟：

  1.用移液器吸走原培養(yǎng)基，加入適量PBS洗1-2遍;
  2.加入適量胰酶，置于培養(yǎng)箱中消化;
  3.待消化到位后加入適量血清或*培養(yǎng)基終止消化，800-1000rpm離心3-5min;
  4.配制凍存液，待細胞離心后去上清，加入凍存液重懸，調(diào)整細胞濃度為3×106~1×107 cells/mL，轉(zhuǎn)移到凍存管中;
  5.將凍存管放入程序降溫盒中，-80度過夜，然后轉(zhuǎn)移到液氮中保存。
  6.凍存細胞后應(yīng)取出一管復(fù)蘇，檢測細胞的存活率。理論上細胞可在液氮內(nèi)長期保存，
為穩(wěn)妥起見可在細胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察細胞生長情況，再繼續(xù)凍存

注意事項
  1.欲冷凍保存之細胞應(yīng)在生長良好且存活率高之狀態(tài)，約為80~90%致密度。
冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。

   2.細胞在液氮中可長期凍存無*，而不會影響細胞活力﹔在-70度可保存數(shù)月。注意冷凍保護劑之品質(zhì)。
DMSO應(yīng)為試劑級等級，無菌且無色是直接購買無菌產(chǎn)品，以5~10m1小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。

   3.凍存細胞數(shù)量要足夠。無論再怎么小心，細胞在冷凍和復(fù)蘇過程中總會死掉一批的。所以，一開始凍存細胞的數(shù)量要足夠。一般要達到5× 10^6 /毫升，一瓶不夠兩瓶湊。但是，這個不能一概而論。有些細胞，比如雜交瘤細胞，只需要1-3x 10^6 /毫升

細胞復(fù)蘇

  1.操作人員應(yīng)戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
   2.自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。
   3.將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內(nèi)。
   4.取出冷凍管，立即放入3℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以7O%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。
   5.取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10~1:15)，混合均勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1m1解凍細胞懸浮液作存活測試。
   6.解凍后是否立即去除冷凍保護劑，依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。
   惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10m1培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心 1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

注意事項
  1.復(fù)蘇速度越快越好。從液氮罐里取出來之后，迅速放在37°C水浴中，搖晃令其盡快融化。

  2.解凍后的細胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清。因為每一種細胞都有自己特定的，并且已經(jīng)熟悉了的生長環(huán)境。突然使用不一樣的培養(yǎng)液和血清，會造成細胞生長不良，甚至死亡。

關(guān)于產(chǎn)品
CryoStor®是Biolife公司特別優(yōu)化的細胞凍存液，在極低溫度 (-70ºC to -196ºC)下準備和保存細胞。預(yù)混DMSO，為細胞和組織的冷凍、儲存和解凍過程提供安全的保護環(huán)境。CryoStor®通過調(diào)控凍存過程的分子生物學(xué)反應(yīng)，無血清、蛋白或具有高細胞毒性的試劑，就能增強細胞活力和功能。

貨號                產(chǎn)品描述                      規(guī)格
210210 CryoStor Cs10 Freeze Media細胞凍存液 1000mL/袋
210202 CryoStor Cs10 Freeze Media細胞凍存液 100mL/袋
210102 CryoStor Cs10 Freeze Media細胞凍存液 100mL/瓶
210374 CryoStor Cs10 Freeze Media細胞凍存液 16mL/瓶
210373 CryoStor Cs10 Freeze Media細胞凍存液  10mL/瓶
現(xiàn)貨供應(yīng)中，欲購從速。